Click-iT 647 Tunel Cell Apoptosis Detection Kit

 

Vöruheiti	Köttur. Nei.	Spec.
Click-iT 647 Tunel Cell Apoptosis Detection Kit	G1509-50T	50T

 

 

Brot á litninga-DNA í frumudauða er hægfara ferli í áföngum. Litninga-DNA er fyrst brotið niður í stóra 50-300 kb hluta með innrænum kjarnsýruhýdrólasa og síðan er um 30% af litninga-DNA skorið af handahófi á milli kjarnaeininga í nærveru Ca2+ og Mg{{3} } háðir kjarnsýra endonucleases til að mynda 180-200 bp nucleosomal DNA fjölliða. Þannig er DNA brotið niður í 180-200 bp brot, í seint frumuddjúp, og mikill fjöldi 3'-OH-enda verður afhjúpaður á brotnu erfðaefnis-DNA. Endanlegur deoxýnukleótídýl transferasi (TdT) er sniðmátóháður DNA pólýmerasi sem hvatar innlimun deoxýríbónukleótíða í 3'-OH enda brotinna DNA sameinda. Þess vegna er hægt að nota TUNEL (TdT miðlað dUTP Nick End Labeling) frumufrumugreiningarsett til að greina brot á kjarna-DNA í veffrumum við seint frumudreifingu.

Meginreglan er sú að undir verkun TdT ensímsins er EdUTP (dUTP með alkýnbreytingum) dópað inn í 3´-OH endann sem verður fyrir áhrifum við erfðafræðilegt DNA brot, og alkýnhópurinn hvarfast við azid litarefnið í hringmyndandi viðbrögðum sem hvata með eingildri koparjón (smellahvörf) sem þannig kynnir flúrljómandi hlutann á markvissan hátt. iF647 azid er notað í þessu setti og því er hægt að greina það með flúrljómunarsmásjá eða flæðifrumumælingu (iF647 örvun 656 nm, losun 670 nm). Í samanburði við önnur breytt dUTP hefur EdUTP minna staðbundið viðnám og er auðveldara að dópa inn DNA enda með TdTase.

Þetta sett hefur margs konar notkun og er hentugur til að greina frumudauða í paraffínvefssneiðum, frosnum vefjum, frumuskriðum og frumustrok.

merkja viðbrögð smella til að bregðast við

 

Mynd 1. Skýringarmynd af smelliefnafræðilegri TUNEL kit meginreglunni

 

 

Skip með blautum ís; Geymið við -20 gráðu í 12 mánuði.

 

 

Íhlutanúmer	Hluti	G1509-50T
G1509-1	Raðbrigða Tdt ensím	50 μL
G1509-2	EdUTP merkingarblöndu	250 μL
G1509-3	Jafnvægisstuðli	5×1 ml
G1509-4	Próteinasi K (200g/mL)	1 ml
G1509-5	iF647 azid litarefni	80 μL
G1509-6	Viðbragðsbuffi A	5×1 ml
G1509-7	Viðbragðsbuffi B	60 μL
G1509-8	Viðbragðsaukefni (hvarfefni C)	2×100 mg
Handbók		1 stk

 

 

1. PBS fosfatbuffi (mælt er með G0002 eða G4202);

2. Föst lausn: 4% paraformaldehýð leyst upp í PBS, pH 7,4 (mælt með G1101);

3. Himnubrjótandi lausn: 0,1% Triton X-100 leyst upp í 0,1% natríumsítrati (ráðlagt með G1204);

4. 0.2% Triton X-100 útbúið í PBS; 0.1% Triton X-100 framleitt í PBS sem inniheldur 5 mg/ml BSA;

5. Fyrir kjarnalitun, gefðu upp þitt eigið DAPI (2 µg/mL), Hoechst 33258, eða PI (1 µg/mL) (G1012, G1011, G1021 mælt með);

6. DNasi I (G3342) fyrir jákvæðar samanburðartilraunir;

7. Hvarfefni (hvarfefni C) er skilið í skilvindu á lágum hraða, 100 mg af duftinu er leyst upp í 1 ml af ofurhreinu vatni (tilbúið til notkunar) og 100 μL er skammtað og geymt við -20 gráðu, þannig að afgangur af dufti til vara; (Auðvelt er að oxa hvarfefni C, reyndu að forðast langvarandi útsetningu fyrir lofti, eftir að hafa verið samsett í vatnslausn er eindregið mælt með því að skipta í litla skammta til notkunar; Eftir að hafa prófað vatnslausnina af hvarfefni C er liturinn á lítilsháttar breyting, smelltu á viðbragðskerfið er enn hægt að framkvæma venjulega, og ef það sýnir brúnan lit, gefur það til kynna að íhluturinn hafi verið ógildur)

8. Ef bakgrunnslitur niðurstöðunnar er of dökkur getur það stafað af ófullnægjandi þvotti og leifar af festiefni meðan á tilrauninni stendur;

9. Gættu þess að bæta við hvarfvökvanum í röð og blandaðu vel á meðan þú bætir við;

10. Fyrir heilsu þína og öryggi, vinsamlegast notaðu rannsóknarfrakka og hanska meðan á notkun stendur.

 

 

1. Sýnaundirbúningur

A. Paraffin-innfelldir vefjaskurðir

a. Parafínvefshlutunum var sökkt í umhverfisvæna tæra afvaxunarlausn (G1128) í 5-10 mín. við stofuhita og endurtekið 3 sinnum; Leggið síðan í vatnsfríu etanóli í 5 mín og endurtakið tvisvar; Að lokum skaltu bleyta í halla etanóli (85%, 75% og tvíeimuðu vatni) einu sinni í 5 mínútur hver;

b. Vættu hlutann varlega með PBS og fjarlægðu umfram vökva í kringum sýnishornið, notaðu PAP penna til að draga lítinn hring með 2-3 mm millibili frá vefnum meðfram útlínu vefsins til að auðvelda gegndræpisvinnslu og jafnvægismerkingar. ekki leyfa sýninu að þorna meðan á tilraunum stendur og geymdu unnin sýni í blautum kassa til að halda sýnunum rökum;

c. Undirbúningur próteinasa K vinnulausnar: Þynnið próteinasa K (200 µg/ml) stofnlausnina með PBS sem þynningarefni í hlutfallinu 1:9 til að fá endanlegan styrk upp á 20 µg/ml;

d. Bætið 100 μL af ofangreindri próteinasa K vinnulausn við hvert sýni til að það sé að fullu þakið og ræktið við 37 gráður í 20 mínútur;

Athugið: Próteinasa K meðferð stuðlar aðallega að gegndræpi litunarhvarfefna í síðari þrepum vefja og frumna og ræktunartími hennar er of langur eða of stuttur til að hafa áhrif á skilvirkni síðari merkingar, til að ná betri árangri, ræktunin. Hægt er að hagræða tíma í samræmi við raunverulegar aðstæður.

e. Þvoið sýnin með því að væta með PBS lausn þrisvar sinnum í 5 mínútur í hvert skipti (þvo þarf próteinasa K hreint, annars truflar það síðari merkingarviðbrögð). Meðhöndluðu sýnin voru sett í blautan kassa til að halda sýnunum rökum;

f. (Valfrjálst skref) Fjarlægðu umframvökvann af sýninu, bætið viðeigandi magni af dropum af himnubrjótandi lausn í vefinn, síast að fullu inn í vefinn og meðhöndlaðu hann í 20 mínútur við stofuhita; eftir að himnubrotsmeðferðinni er lokið er sýnið þvegið á sama hátt með PBS lausn í 3 sinnum, í hvert sinn í 5 mínútur; meðhöndlaða sýnið er sett í blautan kassa til að halda sýninu röku.

 

B. Veffrosinn hluti

a. Veffrosnu hlutarnir eru sökktir í festiefnið og ræktaðir og festir í 10-15 mín. við stofuhita;

b. Vefjahlutarnir eru fjarlægðir úr festiefninu og settir í lofthlíf til að þorna náttúrulega;

c. Vefjahlutir eru vættir og þvegnir í hreinsuðu vatni eða PBS til að fjarlægja leifar af festiefni úr sýninu;

d. Notaðu vefjaefnapenna til að teikna lítinn hring með 2-3 mm millibili frá vefnum meðfram jaðarlínu vefsins til að auðvelda gegndræpisvinnslu og jafnvægismerkingar, ekki leyfa sýninu að þorna meðan á tilraunum stendur og halda vinnslunni. sýni í blautum kassa til að halda sýnunum rökum;

e. Undirbúningur próteinasa K vinnulausnar: Þynnið próteinasa K (200 µg/ml) stofnlausnina með PBS sem þynningarefni í hlutfallinu 1:9 til að fá endanlegan styrk upp á 20 µg/ml;

f. Bætið 100 μL af ofangreindri próteinasa K vinnulausn við hvert sýni til að það sé að fullu þakið og ræktið í 10 mínútur við stofuhita;

Athugið: Próteinasa K meðferð stuðlar aðallega að gegndræpi litunarhvarfefna í síðari þrepum vefja og frumna og ræktunartími hennar er of langur eða of stuttur til að hafa áhrif á skilvirkni síðari merkingar, til að ná betri árangri, ræktunin. Hægt er að hagræða tíma í samræmi við raunverulegar aðstæður.

g. Þvoið sýnið 2-3 sinnum með PBS-lausn til að fjarlægja umfram vökva (þvo þarf próteinasa K hreint, annars truflar það síðari merkingarviðbrögð), og geymið meðhöndlaða sýnishornið í blautum kassa til að halda sýninu röku;

h. (Valfrjálst skref) Bætið hæfilegu magni af dropum af himnubrjótandi lausn í vefinn, síast að fullu inn í vefinn, stofuhitameðferð í 20 mínútur, meðhöndlun á himnubroti er lokið á sama hátt eftir að sýninu er lokið með PBS lausninni til að skola, til að fjarlægja umfram vökva, eftir meðhöndlun sýnisins í blautum kassanum til að halda sýninu blautu.

 

C. Frumuskrið

a. Viðloðandi frumur eru ræktaðar á Lab-Tek skyggnuklefum (Chamber Slides), og skyggnurnar eru varlega vættar og þvegnar 2 sinnum með PBS eftir frumuddjúpunarmeðferð;

b. Viðeigandi magni af festiefni er bætt við hvert glerhólf til að hylja vefinn og ræktað í 20 mínútur við stofuhita;

c. Fjarlægðu festiefnið og bættu PBS við þvott 3 sinnum í 5 mínútur hver;

d. Hvert sýni er sökkt í 0.2% Triton X-100 lausn sem er útbúin í PBS og ræktuð í 5 mínútur við stofuhita til að gera gegndræpi;

e. Þvoið sýnin með því að sökkva þeim 2-3 sinnum í opið bikarglas sem inniheldur PBS lausn;

f. Fjarlægðu varlega umfram vökva og notaðu síupappír til að þvo vökvanum varlega í kringum sýnishornið á glærunni. Unnið sýni er sett í blautan kassa til að halda sýninu röku.

 

D. Frumustrok

a. Frumur eru endursviflausnar í PBS í styrkleika sem er um það bil 2 × 107 frumur/ml, og 50-100 μL af frumusviflausn er sogað á glæru gegn losun og hreint gler er notað til að dreifa frumusviflausninni varlega;

b. Frumustrokunum er sökkt í litunarkrukku sem er fyllt með festilausn, og frumurnar eru festar og látnar vera við 4 gráður í 25 mínútur;

c. Dýfðu rennibrautinni í PBS og láttu það vera við stofuhita í 5 mínútur til að bleyta og skola, endurtaktu einu sinni;

d. Fjarlægðu umframvökvann varlega og þerraðu umframvökvann varlega í kringum sýnishornið á glærunni með síupappír, teiknaðu lítinn hring eftir útlínu frumunnar með vefjaefnapenna til að auðvelda gegndræpisvinnslu og jafnvægismerkingar, og ekki leyfa sýnið að þorna meðan á tilrauninni stendur;

e. Hvert sýni er sökkt í 0.2% Triton X-100 lausn sem er útbúin í PBS og ræktuð í 5 mínútur við stofuhita til að gera gegndræpi;

f. Þvoðu sýni með því að sökkva þeim 2-3 sinnum í opið bikarglas sem inniheldur PBS lausn

g. Fjarlægðu umfram vökva varlega og þerraðu vökvanum varlega í kringum sýnishornið á glærunni með síupappír. Haltu sýninu röku með því að setja meðhöndlaða sýnið í blautan kassa.

 

2. DNase I meðferð jákvæð viðmiðunartilraun (valfrjálst skref)

Eftir gegndræpi sýnismeðferðar eru sýni meðhöndluð með DNase I (mælt með G3342) til að undirbúa jákvæða samanburð.

2.1. 100 μL af 1×DNase I Buffer (undirbúningur: taktu 10 μL af 10×DNase I Buffer, bættu síðan við 90 μL af afjónuðu vatni og blandaðu vel saman) er bætt í dropatali við gegndræpnu sýnin og ræktað í 5 mínútur við stofuhita;

2.2. Fjarlægðu varlega umfram vökvann, bættu 100 μL af vinnulausn sem inniheldur DNase I (20 U/mL) (undirbúningsaðferð: taktu 10 μL af 10× DNase I buffer, bættu síðan við 2 μL af DNase I og bættu síðan við 88 μL af afjónuðu vatni til að blanda), og ræktað í 10 mínútur við stofuhita;

2.3. Fjarlægðu varlega umfram vökva og þvoðu glærurnar vandlega 3-4 sinnum í litunarkeri sem er fyllt með PBS.

Athugið: Jákvæðar samanburðarskyggnur verða að vera litaðar með því að nota sérstakt litunarker, annars gæti leifar DNase I á jákvæðu samanburðarglasunum haft háan bakgrunn á tilraunaglasinu.

 

3. Merking og uppgötvun

3.1. Jafnvægi: Bætið 50 μL jafnvægisbuffi við hvert sýni til að hylja allt sýnissvæðið og ræktið í 10 mínútur við stofuhita;

3.2. Undirbúningur merkingarlausnar: Þiðið EdUTP merkingarblöndu og jafnvægisbuffa á ís og blandið nægilega miklu TdT ræktunarbuffi fyrir allar tilraunir í samræmi við hlutfall raðbrigða TdT ensíms: EdUTP merkingarblöndu: Jafnvægisbuffi=1 µL:5 µL:50 µL ( 1:5:50), er hægt að stilla rúmmál hvarfefna sem notuð eru í tilteknu tilraununum til jafns hlutföll eftir stærð glæranna;

3.3. Neikvætt stýrikerfi: Útbúið viðmiðunar-TdT ræktunarbuffi án raðbrigða TdT ensíms og skiptið út fyrir ddH2O;

3.4. Merking: Fjarlægðu eins mikið jafnvægisbuff og mögulegt er, bættu síðan 56 μL af TdT ræktunarbuffi við hvert vefjasýni og ræktaðu við 37 gráður í 1 klst; gætið þess að þurrka ekki rennibrautirnar;

3.5. Þvoðu vefjasýnin strax með PBS í 4 þvotta á 5 mín hvorum;

3.6. Smelluviðbrögð: Fjarlægðu PBS biðminni úr fyrra skrefi, bættu 100 μL af smelluhvarflausn í dropatali á sýnið til að hylja sýnið, ræktaðu í 30 mínútur við stofuhita fjarri ljósi; (sjá eftirfarandi töflu fyrir smelluhvarfkerfið, bætið hverju hvarfefni við í röð, blandið vel saman á meðan því er bætt við og hægt er að auka eða minnka magn efnablöndunnar hlutfallslega og mælt er með því að undirbúa það fyrirfram)

 

Hluti	Bindi
Viðbragðsbuffi A	925 μL
Viðbragðsbuffi B	10 μL
iF647 azid litarefni	15 μL
Viðbragðsaukefni (hvarfefni C)	50 μL
Heildarmagn	1000 μL

 

3.7. Fjarlægðu smellhvarflausnina og þvoðu strax með PBS buffer 2-3 sinnum í 5 mínútur hver;

3.8. Þurrkaðu varlega af PBS lausninni í kringum sýnið með síupappír;

3.9. Kjarnalitun: Sýni eru lituð í litunarkeri, þar sem skyggnum er sökkt í myrkri í litunarker sem inniheldur DAPI lausn (nýgerð og þynnt með PBS) og látin standa við stofuhita í 8 mínútur (eða kjarnalitun er framkvæmd með Hoechst 33258 );

3.10. Lokun: Eftir að sýnin hafa verið lituð eru vefjasýnin þvegin þrisvar sinnum með PBS í 5 mínútur í hvert sinn, síðan er umframvökvi fjarlægður varlega og sýnin lokuð með dropum af flúrljómandi slökkviþéttiefni (mælt með G1401);

3.11. Smásjárskoðun: Greindu sýnin samstundis undir flúrljómunarsmásjá, glærur eru verndaðar gegn ljósi, DAPI litar bæði apoptotic og non-apoptotic frumur bláar og aðeins í kjarna apoptotic frumna er bleik flúrljómun staðbundin með iF647 azid dye íblöndun.

 

Aðeins til rannsóknarnotkunar!

 

 

maq per Qat: click-it 647 tunel cell apoptosis uppgötvun Kit, Kína click-it 647 tunel cell apoptosis uppgötvunarsett framleiðendur, birgjar, verksmiðju