EF555-Phalloidin blettur

 

Vöruheiti	Köttur. Nei	Spec.
EF555-Phalloidin blettur	G1249-100T	100 T

 

 

Phalloidin, sem upphaflega var einangrað sem tvíhringlaga peptíð úr eitruðu sveppunum Amanita phalloides, binst aktínþráðum F-aktíni með mjög mikilli sækni og sérhæfni og bindur ekki einliða aktín (G-aktín). Phalloidin hefur svipaða sækni í litlar og stórar trefjar og binst í raun í samræmi við stoichiometric hlutfall einnar aktínundireiningar við eina phalloidin sameind í vöðva- og óvöðvafrumum margra mismunandi plöntu- og dýrategunda. Ólíkt aktínmótefnum breytist sækni í vélknúin prótein verulega frá einni tegund eða uppruna til annarrar. Ósértæk binding phalloidins er nánast hverfandi og munur á lituðu og ólituðu svæðum er mjög áberandi. Phalloidin og afleiður þeirra geta litað F-aktín í nanómólstyrk, sem gerir mjög auðvelda merkingu, auðkenningu og magnrannsókn á F-aktíndreifingu.

Þessi vara er flúrljómandi litarefni IF555-merkt phalloidin, samkvæmt notkun 100 μL af vinnulausn í hverri holu frumulitun, er hægt að nota þessa vöru fyrir 100 frumu litun.

 

 

Flutningur með blautum ís. Geymið við -20 gráðu fjarri ljósi, gildir í 12 mánuði.

 

 

Hluti	G1249-100T
EF555-Phalloidin blettur	100 T
Leiðbeiningarhandbók	1 stk

 

 

1. Undirbúðu þitt eigið1×PBS biðminni(pH 7.2-7.4, mælt meðG4202), BSA(mælt meðGC305010), festingarefni(inniheldur 4% paraformaldehýð, mælt með þvíG1101), filmubrotslausn(0.1%-0.5% Triton X-100 leyst upp í PBS, mælt meðG1204), flúrljómunardeyfandi þéttiefni(mælt meðG1401), DAPI litunarlausn sem er tilbúin til notkunar(mælt meðG1012), o.s.frv.

2. Þegar þú notar þessa vöru í fyrsta skipti skaltu bræða að fullu og skilvindu á lágum hraða í 1 mín til að koma í veg fyrir tap á vökvarörveggnum. Mælt er með því að skammta vöruna í samræmi við það magn sem notað er í einni tilraun til að koma í veg fyrir tap á leysi við rokgjörn. Geymið í -20 gráðu fjarri ljósi.

3. Fyrir formlegar tilraunir var PBS sem innihélt 1% BSA búið til, þ.e. 1,0 g BSA var leyst upp í 100 ml af PBS. 1 μL af IF555-Phalloidin bletti var síðan sogað og blandað saman við 200 μL-500 µL af PBS sem innihélt 1% BSA til að fá 1× af Phalloidin Staining Working Solution. Litunaráhrifin geta verið mismunandi fyrir mismunandi gerðir frumna, vinsamlegast skoðaðu fræðirit til að fá ákjósanlegasta litunarstyrk eða framkvæma forprófið til að komast að því. Notaðu Phalloidin litunarlausnina sama dag og hún er útbúin og geymd við stofuhita og varin gegn ljósi.

 

 

1. Ræktuðum frumum var skriðið (með þéttleika sem er að minnsta kosti hálft samruni), ræktunarmiðillinn var fjarlægður og frumurnar voru þvegnar með 1× PBS buffer sem var forhitað við 37 gráður til að þvo frumurnar 2 sinnum;

2. Festaefni sem inniheldur 3.0-4.0% formaldehýðs var bætt við til að hylja frumurnar og fest í 15-30 mín við stofuhita;

Athugið: Metanól eyðileggur aktín, þannig að festiefnið má ekki innihalda metanól og forðast að nota formaldehýðlausnir sem innihalda metanól;

3. Frumur voru þvegnar með 1× PBS biðminni 2-3 sinnum í 10 mínútur hver við stofuhita;

4. Frumurnar voru huldar með PBS sem innihélt 0.1% Triton X-100 við stofuhita og gegndræpnar í 5 mínútur við stofuhita;

5. Frumur voru þvegnar með 1× PBS jafnalausn 2-3 sinnum í 10 mínútur hver við stofuhita;

6. Eftir að frumuskriðin voru hrist lítillega þurr, teiknaðu hring með pap penna þannig að frumurnar væru staðsettar í miðju hringsins. Taktu 100 μL af tilbúnu IF555-Phalloidin litunarlausninni til að hylja frumurnar alveg og ræktaðu við stofuhita og fjarri ljósi í 30-120 mín. Athugaðu að venjulega er 4-37 gráðu hentugur fyrir litun. Til að koma í veg fyrir uppgufun á litunarlausninni sem leiði til þurrra sneiða, krefst ræktunarferlið að frumukríðið sé komið fyrir í lokuðu íláti, eins og ljósþéttum blautum kassa. Að auki getur viðbót á 1% BSA við Phalloidin litunarlausnina í raun dregið úr bakgrunni;

7. Frumur voru þvegnar með 1× PBS biðminni 2-3 sinnum í 5 mínútur í hvert sinn;

8. (Valfrjálst)Bætið dropum af DAPI-litunarlausn sem er tilbúinn til notkunar í skriðgluggana til að hylja frumurnar og framkvæmið kjarnalitun í 3-5 mín. þvoðu frumurnar með 1× PBS biðminni 2-3 sinnum í 30-60 sek. hver;

9. Frumuskrið var hrist örlítið þurrt og hvolft á rennibraut með dropa af flúrljómunardeyfandi þéttiefni, og þéttiefninu var strokið af með pappírshandklæði;

[Valfrjálst skref]:Eftir að hafa lokið skrefi 7 er einnig hægt að snúa hyljaranum beint á glæru sem er títruð með flúrljómandi slökkviþétti sem inniheldur DAPI (Mælt er með G1407), og þá er hægt að soga af umframþéttiefninu. Fylgstu með niðurstöðunum með flúrljómunarsmásjá eða laser confocal smásjá.

10. Niðurstöðurnar sáust með flúrljómunarsmásjárskoðun eða leysisfókussmásjá þar sem IF555(Ex/Em=556/574 nm) og DAPI (Ex/Em=364/454 nm) rásirnar voru valdar.

 

 

1. Ein eining (T) af flúrljómandi merktu Phalloidin er skilgreint sem magn litarefnis sem notað er til að lita glæru af hlaðnum frumum.

2. Metanól getur eyðilagt aktínprótein, þannig að festingarlausn sem inniheldur metanól ætti ekki að nota við fyrstu festingu sýna. Mælt er með því að festingartíminn sé stjórnaður á milli 15-30 mín.

3. Phalloidin er venjulega ekki gegndræpi og er sjaldan notað til litunar á lifandi frumum.

4. Öll flúrljómandi litarefni eru slökkt og því er mælt með því að ljúka greiningu sama dag og mögulegt er eftir litun.

5. Phalloidin er eitrað og ætti að meðhöndla það með varúð. Notaðu rannsóknarfrakka og einnota hanska meðan á aðgerð stendur.

 

Aðeins til rannsóknarnotkunar!

 

 

maq per Qat: if555-phalloidin blettur, Kína if555-phalloidin blettur framleiðendur, birgjar, verksmiðja